反式西红花酸-环糊精包合物的制备、表征、安全性和抗肿瘤评价

)是西红花与栀子等中的主要活性成分之一,具有抗癌、改善溃疡结肠炎、神经保护和保肝护脏等药理活性。但其几乎不溶于水、乙醇、甲醇、醋酸乙酯,易溶于碱溶液,口服吸收差,易氧化不稳定,极大地限制了其药理效应的发挥。环糊精是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖以及其半合成衍生物的总称。环糊精在食品和药品行业有着广泛应用,在药物制剂中环糊精常作为药物载体用于提高药物溶解度、提高药物稳定性、矫味、缓释和靶向作用等环糊精及其衍生物。不同环糊精因结构差异使得其包合性能有所不同。采用环糊精包合技术拟提高环糊精包合物的制备工艺、质量表征、体外释药、吸收机制、安全性和抗肿瘤药理活性进行较系统的研究,为后续

实验用斑马鱼,4月龄野生型AB斑马鱼,购买于南京一树梨花公司。雄性裸鼠,SPF级,体质量(22±2)g,购买于江苏凯基生物技术股份有限公司,所有动物实验遵循南京中医药大学伦理委员会有关实验动物管理和使用的规定,均符合3R原则。

2.1.2供试品溶液的制备精密称取TC-MβCD冻干粉10 mg,置20 mL量瓶中,加流动相稀释,超声破化包合结构,使其充分溶解,冷却至室温,加流动相稀释至刻度,摇匀。

精密度试验取12.024 μg/mL对照品溶液,连续重复进样6次,每次20 μL,峰面积的RSD为0.39%,结果表明仪器精密度良好。2.1.5

稳定性试验按“2.1.2”项下方法制备包合物供试品溶液,取12.024 μg/mL TC对照品溶液和TC包合物供试品溶液,分别在0、2、4、6、8、10 h进行测定,前者RSD为0.47%,后者RSD为1.44%,结果表明10 h内对照品溶液和供试品溶液稳定。2.1.6

重复性试验按照“2.1.2”项下方法制备包合物供试品溶液6份,包合物中TC的平均质量分数为2.25%,RSD为0.77%,结果表明该方法重复性良好。2.1.7

加样回收率试验取9份TC-MβCD包合物,精密称定,分别按样品中TC含量添加TC对照品适量(80%、100%、120%各3份),测得TC平均加样回收率为96.37%,RSD为2.15%,结果表明该方法回收率良好。2.1.8

样品测定取各实验项下样品,制备成供试品溶液,按“2.1.1”项色谱条件检测各个样品中TC含量。2.1.9

数据处理所有数值均表示为。显着性的统计分析通过SPSS 19.0软件(美国SPSS公司)进行。使用t检验评估各组之间的差异,将P<0.05视为具有统计学意义。2.2

环糊精种类、用量和温度对TC的增溶试验分别精密称定α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、MβCD、羟丙基-β-环糊精,用蒸馏水分别配制成浓度分别为2、4、6、8、10 mmol/L的溶液。加入过量TC于上述溶液中,分别在15、37、60℃避光条件下置于电热恒温震荡水槽(转速为200 r/min)振摇48 h,溶解平衡后,微孔滤膜滤过(0.45 μm),测定滤液中TC的含量。表1结果表明,当不添加环糊精时,TC在水中的溶解度很小,仅有0.72 μg/mL,当添加环糊精后,TC在水中的溶解度增大,其增溶效果与环糊精种类、用量和温度有关。环糊精浓度越大、温度越高、增溶效果越好。但是只有MβCD对TC的增溶效果显著,其他4种环糊精增溶效果不理想。

对TC的K逐渐增大,说明升高温度包合效果越好。MβCD在不同温度下,与TC包合的吉布斯自由能变化(Δ G)<0,表明MβCD与TC的包合自发进行,根据热力学第2定律,疏水作用在包合中起主要作用。2.3

TC置于溶液中,在恒温磁力搅拌器上搅拌(转速1000 r/min)一定时间,冷冻干燥,即得TC-MβCD包合物。2.3.1

单因素实验考察环糊精用量和搅拌条件对TC-MβCD包合率的影响以不同MβCD质量分数(0、10%、30%、50%、70%)、不同搅拌时间(30、60、90、120、150 min)、不同搅拌温度(40、50、60、70、80℃)以及不同搅拌速率(200、500、1000、1500 r/min)为考察因素,包合率为评价指标,考察各单因素对TC-MβCD包合率的影响,结果不同MβCD质量分数时TC-MβCD的包合率分别为0、(38.6±3.3)%、(78.4±3.8)%、(85.6±4.3)%、(86.2±3.7)%(n=3),不同搅拌时间时TC-MβCD的包合率分别为(32.6±4.2)%、(57.3±2.3)%、(78.6±3.4)%、(81.7±2.3)%、(74.3±3.6)%(n=3),不同搅拌温度时TC-MβCD的包合率分别为(56.4±1.2)%、(78.6±2.0)%、(82.2±1.7)%、(82.6±1.9)%、(83.0±1.5)%(n=3),不同搅拌速率时TC-MβCD的包合率分别为(73.6±1.4)%、(76.9±1.9)%、(77.4±1.8)%、(78.6±2.0)%、(78.3±1.6)%(n=3)。结果表明,MβCD用量越大,温度越高,包合率越高,但温度大于60℃后包合率增加不明显。包合率随着搅拌时间延长相应提高,但大于150 min后包合率反而下降。搅拌转速对包合率的影响不显著。2.3.2

采用Box-Behnken响应面法优化包合工艺参数选取影响包合效果较大的MβCD质量分数(X1)、搅拌温度(X2)和搅拌时间(X3)3个因素,设置3个水平对15个试验点[16]。结果见表3。使用Design-Expert 8.0.6软件对上表数据进行2

结果表明,模型优化后给出的最佳参数为料液比33.74%、搅拌温度58.41℃、搅拌时间127.12 min、包合率为86.614%。结合大生产对工艺参数进行修正,得到TC-MβCD包合工艺料液比33%,搅拌温度60℃,搅拌时间120 min。采用以上包合工艺制备3

、85.7%、87.0%,结果表明,该工艺重复性良好,根据星点设计实验所建立的数学模型预测性良好。2.4TC-MβCD包合物的表征

利用紫外-可见分光光度计检测原料药的吸收峰与包合的吸收峰之间的差异[13,18]

原料药及包合物的形态[17],图4结果表明TC呈微小颗粒结晶形状,MβCD呈原弧片状形片状,而包合物不同于主客体的形貌,大小和形状呈现了不规则的块状形貌,以上表明主客体之间形成了包合物,结构性质发生改变。2.5

的体外释放[19-20]精密称取一定量的TC原料药和等药量的TC- MβCD

包合物,用0.1%聚山梨酯-80 pH 6.8的水溶液混悬后放入截留相对分子质量1000的透析袋内,两端用透析夹夹紧保证不渗漏,分别置于以900 mL 0.1%聚山梨酯-80 pH 6.8的水溶液为介质的溶出杯中,将其置于智能溶出仪中,设置温度(37.0±0.1)℃,转速75 r/min,进行体外释放,取样点分别为10

、15、30、45、60、90 min及2、3、4、6、8、10、12、18 h。每次取样10 mL,同时补加相同温度的等量介质溶液。样品溶液用0.45 μm针筒滤头过滤后,进样测定TC的质量浓度,计算累积释放率。TC原料药因为在释放介质中溶解度太低,HPLC难以检测,未绘制出释药曲线。TC-MβCD包合物的药物释放曲线结果表明,TC从包合物中的释放符合一级速率释药,具有缓释效果。2.6Caco-2细胞模型研究

Transwell培养板,首先,将细胞单层用预热(37℃)的空白汉克平衡盐溶液(HBSS)洗涤3次,在Apical侧(AP)到Basolatera侧(BL)的转运试验中,将等浓度的TC溶液与TC-MβCD包合物溶液加0.5 mL到AP面作为供给池,将1.5 mL HBSS(pH 7.4)添加到BL中作为接收池。在BL到AP转运试验中,将等浓度的TC溶液或TC- MβCD包合物溶液分别加1.5 mL到BL中,并将0.5 mL HBSS添加到AP中。每个实验组设置3个平行孔。置37℃培养箱中培养,分别在120 min时吸取接收池溶液各200 μL进行HPLC测定。结果见表6。TC的Papp(AP→BL)值与Papp(BL→AP)值与相差不大(P>0.05),说明TC跨越肠上皮细胞的可能主要转运途径为被动扩散。但TC的Papp(AP→BL)值与Papp(BL→AP)值与TC-MβCD包合物有显著性差异(P<0.05),说明包合促进了TC的吸收,从TC和TC-MβCD包合物的Papp(BL→AP)/ Papp(AP→BL)值均小于1.5可以看出TC可能不存在外排转运机制。TC并非通过胞旁转运及载体介导的转运,而是主要通过被动的跨细胞扩散而渗透[2]。2.7TC-MβCD包合物对斑马鱼鱼卵/

E3溶液配制好的含TC不同质量浓度(10、50、100、150、200 μg/mL)的TC-MβCD包合物溶液分别加入到相应的孔中,每孔加入3 mL溶液,每个浓度设置2个复孔。每孔的鱼卵作为1个统计数据。分别于24、48、72、96 hpf观察胚胎的发育情况,并统计24、48、72、96 hpf的胚胎累积死亡率、畸形率、孵化率以及72、96 hpf的心率、体长等。心率的检测方式:在Leica DMi8显微镜4倍视野下计算斑马鱼幼虫心脏1 min完成搏动的次数。体长的计算方法:在Leica DMi8显微镜4倍视野下测量斑马鱼幼虫眼睛中心到尾巴末端的直线,结果表明TC-MβCD包合物中TC不同质量浓度(10、50、100、150、200 µg/mL)持续孵育下的斑马鱼卵/幼虫的存活率均在90.0%及以上。将所得存活率的数据进行统计学分析,发现与对照组相比,不同质量浓度下TC-MβCD包合物孵育后的斑马鱼鱼卵/幼虫的存活率均无显著性差异。由表8可知,TC-MβCD包合物不同质量浓度(10、50

、150、200 µg/mL)持续孵育下的斑马鱼卵/幼虫的累积孵化率最低值均出现在200 µg/mL的质量浓度下,其72、96 hpf的孵化率平均孵化率为86.70%和85.08%。将所得孵化率的数据进行统计学分析,发现与对照组相比,不同质量浓度下TC-MβCD包合物孵育后的斑马鱼鱼卵/幼虫的孵化率无显著性差异。表9结果表明,将所得心率的数据进行统计学分析,发现与对照组相比,不同质量浓度下TC- MβCD包合物孵育后的斑马鱼鱼卵/幼虫的心率无显著性差异。

200 µg/mL质量浓度时TC-MβCD包合物对斑马鱼的孵化率产生一定程度的影响,但是其对斑马鱼胚胎的存活和心率的影响较弱。但进行涉及到生殖毒性或者对安全性要求较高水平的科学研究,并使用环糊精和TC时,建议将质量浓度控制在

用含10%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃、饱和湿度、含5% CO 2的培养箱中培养

4T1细胞。取对数生长期、生长状态良好的4T1细胞(乳腺癌细胞),用0.25%胰酶消化后细胞计数。将4T1细胞接种到96孔板中,每孔7000个细胞。经过预实验确定加入的TC原料药的浓度为0、50、100、200、300、400、500 μmol/L和TC-MβCD包合物制剂浓度为(以TC计)0、25、50、100、200、300、400 μmol/L,以未处理的细胞为对照。第2天,根据药物浓度的不同将细胞分成12组,更换含有相应浓度药物的培养基,继续培养。每种浓度6个重复进行测试。处理48 h后进行CCK8检测,即各组细胞在检测时间点时,每孔加10 μL CCK8溶液,继续在37℃、5% CO 2培养箱中培养3 h。选择450 nm波长,在酶标仪法上测定各孔吸光度(A)值,记录结果。利用GraphPad Prism软件的Dose-response- inhibition算法计算得出药物对细胞的半数致死浓度(IC50),结果见图7。结果表明,TC原料药随着浓度增大其乳腺癌细胞存活率下降,且呈明显的浓度依赖性。在低浓度时(≤200 μmol/L)包合物与原料药相比细胞存活率相差不大。在高浓度时(≥200 μmol/L)细胞存活率包合物均小于原料药。经GraphPad Prism软件计算,原料药对4T1细胞的IC 50=356.0 μmol/L,包合物制剂对4T1细胞的IC 50=283.5 μmol/L,说明TC包合物比TC原料药对乳腺癌细胞有更强的抑制作用。2.9裸鼠体内MCF-7肿瘤模型研究

与TC- MβCD包合物的体内抗肿瘤活性2.9.1动物分组与模型的建立实验前将雄性裸鼠(22±2

)g保持在无病原体的条件下,正常进食饮水1周后,将对数生长期的0.1 mL MCF-7细胞悬液(1×107细胞/mL)接种到雄性裸鼠的右腋皮下,建立肿瘤模型。当平均肿瘤模型体积达到60 mm3时,将小鼠随机分为3组(n=6):对照组、TC组、TC-MβCD组。2.9.2给药与治疗对照组、TC组和

TC-MβCD包合物组分别以0.9%盐溶液,游离的TC(含50 mg/kg TC的0.5%羟丙基甲基纤维素溶液)和TC-MβCD包合物(相当于50 mg/kg的TC)剂量ig从第1天到第12天,每天1次。肿瘤体积用游标卡尺测量,并在第1、3、5、7、9、11、13天测量小鼠的肿瘤体积。并进行统计学分析。在实验结束时,对动物实施安乐死并剥离肿瘤,统计分析肿瘤体积,计算肿瘤体积抑制率。然后对肿瘤进行苏木精和曙红(HE)染色以评估病理变化。2.9.3结果图8

结果表明,TC和TC-MβCD包合物均对肿瘤表现出治疗作用,并在给药后,伴随着肿瘤坏死。与TC治疗相比,TC-MβCD包合物治疗后肿瘤的HE染色显示细胞间间隙增大,组织坏死增加。治疗2周的体积-时间曲线所示。与对照组相比,两者相同剂量的TC和TC-MβCD包合物,TC-MβCD包合物的抑制率为33.71%,远高于TC(16.86%),TC-MβCD包合物增强了TC的抗肿瘤作用(P<0.05)。3讨论本研究比较了α-环糊精、

环糊精、MβCD、羟丙基-β-环糊精对TC的增溶效果,发现只有MβCD对TC的增溶效果显著,其他4种环糊精增溶效果一般。环糊精包合方法有饱和水溶液法、超声法、研磨法、冷冻干燥法、喷雾干燥法等,考虑到TC-MβCD的易溶于水和热稳定性,选择冷冻干燥法制备TC-MβCD;单因素实验发现MβCD用量越大,包合温度越高,包合时间越长,TC的包合率越高,但温度大于60℃后包合率增加不明显,包合时间大于150 min后包合率反而下降,此外发现搅拌转速对包合率的影响不显著;采用Box- Behnken响应面法优选出最佳包合条件为料液比33%,搅拌温度60℃,搅拌时间120 min。本实验采用SEM和紫外光谱验证了TC-MβCD包合物的形成,采用Caco-2细胞模型研究了TC与TC-MβCD的体外转运机制,发现包合物能促进

TC的吸收。体外释放度研究表明,TC包合物显著提高了TC的溶解度并具有一定的缓释作用,释药模型呈一级释放模型。环糊精包合物中药物在消化道的释药除了与包合物中药物的扩散渗漏有关外,还受消化酶和大肠菌群对环糊精的降解和消化道其它成分的置换等因素影响,但目前的释放介质难以复制这些因素,后续将进一步开展TC-MβCD的结构和药动学系统性研究以阐明环糊精包合对TC生物利用度的影响。裸鼠体内MCF-7肿瘤模型试验发现,与TC原料药相比,TC

包合物的体内抗肿瘤药理活性明显增强,这可能是由于环糊精包合物的增溶和缓释作用,提高了TC的生物利用度所致。由于CCK-8检测非常方便快捷,且CCK-8对细胞的毒性很小,检测灵敏度高且重复性好,故体外抗肿瘤选用CCK8检测。体外乳腺癌4T1细胞模型试验表明TC包合物比TC原料药对乳腺癌细胞有更强的抑制作用。采用斑马鱼鱼卵/胚胎发育试验发现,TC-MβCD包合物对斑马鱼的孵化率、斑马鱼胚胎的存活和心率几乎没有影响,表明包合物安全性好。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突参考文献(略)返回搜狐,查看更多责任编辑:

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